HPLC分析に用いる緩衝液の調製
HPLC分析ではイオン性成分分析時に、分離の再現性やピーク形状の安定性を確保することを目的として、水系移動相に緩衝液を用いることがあります。緩衝液を調製する方法には以下の2つの方法があります。
1）所定のpHになるように酸(または塩基)を水溶液に滴下して調製
2）あらかじめ計算された塩と酸(塩基)を秤量して調製
多くの試験法では、1）の方法での調製法が記載されています。この方法では、僅かなpHの誤差により分離の再現性に影響することがあり、こまめにpHメーターを点検/校正する必要があります。
2）の方法では、pHメーターを使わずに緩衝液を調製することができます。このページでは、｢あらかじめ計算された塩と酸(塩基)の一定量を秤量し調製する｣際のレシピを紹介します。
なお、当社製分析天びんAP-Wシリーズには、2）の方法による緩衝液調製のレシピが登録されており、画面上の表示に従って秤量後、水で溶解させることによって、緩衝液を容易に調製することができます。
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＜緩衝液の注意点＞
〇緩衝液の表記
使用する緩衝液の表記が「100 mmol/L りん酸(ナトリウム) 緩衝液 pH=2.1」の場合、酸にはりん酸を、対イオンにはナトリウムを用いた緩衝液で、りん酸根の全濃度が100 mmol/L、その緩衝液のpHが2.1であることを意味します。
〇緩衝作用
酢酸と酢酸ナトリウムの濃度比率が1:1の水溶液を調製すると、そのpHは酢酸のpKa付近の約4.7になります。これは酢酸(ナトリウム)緩衝液の緩衝作用が最大の状態です。緩衝液の濃度が高くなるほど、その緩衝作用は大きくなります。
〇塩の溶解度，析出
有機溶媒と混合したときに析出しやすくなります。また、緩衝液の濃度が高いほど析出しやすくなります。緩衝液の対イオンの種類（例：）が異なると、塩の溶解度が異なります。
〇UV吸収
UV短波長で高感度分析を行う際には、UV吸収を持つ有機酸(カルボン酸)系の緩衝溶液を出来るだけ避けましょう。
参考資料
<緩衝液の調製法＞
| 100 mmol/L りん酸(ナトリウム)緩衝液 pH=2.1 りん酸二水素ナトリウム二水和物(M.W.=156.01)･･50 mmol(7.8 g) りん酸(85%,14.7 mol/L)･････････････････････････50 mmol(3.4 mL) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 10 mmol/L りん酸(ナトリウム)緩衝液 pH=2.6 りん酸二水素ナトリウム二水和物(M.W.=156.01)･･･5 mmol (0.78 g) りん酸(85%,14.7 mol/L)･････････････････････････5 mmol (0.34 mL) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 (100 mM りん酸(ナトリウム)緩衝溶液 pH=2.1 を1/10に希釈してもよい) |
| 50 mmol/L りん酸(ナトリウム)緩衝液 pH=2.8 りん酸二水素ナトリウム二水和物(M.W.=156.01)･･40 mmol (6.24 g) りん酸(85%,14.7 mol/L)････････････････････････10 mmol (0.68 mL) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 100 mmol/L りん酸(ナトリウム)緩衝液 pH=6.8 りん酸二水素ナトリウム二水和物(M.W.=156.01)･･･50 mmol (7.8 g) りん酸水素二ナトリウム12水和物(M.W.=358.14)･･50 mmol (17.9 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 10 mmol/L りん酸(ナトリウム)緩衝液 pH=6.9 りん酸二水素ナトリウム二水和物(M.W.=156.01)････5 mmol (0.78 g) りん酸水素二ナトリウム12水和物(M.W.=358.14)･･･5 mmol (1.79 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 (100 mmol/L りん酸(ナトリウム)緩衝溶液 pH=6.8 を1/10に希釈してもよい) |
| 20 mmol/L くえん酸(ナトリウム)緩衝液 pH=3.1 くえん酸一（いち）水和物(M.W.=210.14)･･････････････16.7 mmol (3.51 g) くえん酸三ナトリウム二水和物(M.W.=294.10)･････3.3 mmol (0.97 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 20 mmol/L くえん酸(ナトリウム)緩衝液 pH=4.6 くえん酸一（いち）水和物(M.W.=210.14)････････････････10 mmol (2.1 g) くえん酸三ナトリウム二水和物(M.W.=294.10)･･････10 mmol (2.94 g) 水に上記を入れ全量1Lとする。 |
| 10 mmol/L 酒石酸(ナトリウム)緩衝液 pH=2.9 酒石酸(M.W.=150.09)･･････････････････････････7.5 mmol (1.13 g) 酒石酸ナトリウム二水和物(M.W.=230.08)････････2.5 mmol (0.58 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 10 mmol/L 酒石酸(ナトリウム)緩衝液 pH=4.2 酒石酸(M.W.=150.09) ････････････････････････2.5 mmol (0.375 g) 酒石酸ナトリウム二水和物(M.W.=230.08)･･･････7.5 mmol (1.726 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 20 mmol/L (酢酸)エタノールアミン緩衝液 pH=9.6 モノエタノールアミン(M.W.=61.87、d=1.017)･･・20 mmol (1.22 mL) 酢酸(氷酢酸、17.4 mol/L)･･････････････････････10 mmol (0.575 mL) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 100 mmol/L 酢酸(ナトリウム)緩衝液 pH=4.7 酢酸(氷酢酸) (99.5%,17.4 mol/L)････････････････50 mmol (2.87 mL) 酢酸ナトリウム三水和物(M.W.=136.08)･････････50 mmol (6.80 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 100 mmol/L ほう酸(カリウム)緩衝溶液 pH=9.1 ほう酸(M.W.=61.83)･･････････････････････････100 mmol (6.18 g) 水酸化カリウム(M.W.=56.11)･･･････････････････50 mmol (2.81 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
| 100 mmol/L ほう酸(ナトリウム)緩衝液 pH=9.1 ほう酸(M.W.=61.83)･･････････････････････････100 mmol (6.18 g) 水酸化ナトリウム(M.W.=40.00)･････････････････50 mmol (2.00 g) 水に上記を入れ全量1 Lとする。 |
