標準液・試料溶液の自動希釈調製分析法
HPLC 分析において，標準液や試料溶液の希釈調製は通常手作業で行われますが，このような作業には経験や知識が必要な上，手間と時間がかかることも少なくありません。このプロセスを自動化できれば，分析のスループットを大きく向上させることが期待できます。
ここでは，超高速LC“Nexera X2”シリーズ SIL-30AC オートサンプラの前処理機能を活用して，標準液や試料溶液を自動希釈調製することにより，絶対検量線法による定量分析を省力化した例をご紹介します。
絶対検量線法における標準液・試料溶液の調製
HPLC による定量分析で広く用いられる絶対検量線法では，既知濃度の分析種標準液を数点調製し，これらを分析することにより，濃度とピーク面積あるいはピーク高さとの関係式，つまり検量線を得ます。そして，この検量線を用いて試料溶液を分析して得られたピーク面積あるいはピーク高さから分析種の濃度を算出します。この時，基本的に検量線は直線となる濃度範囲で設定し，試料溶液もその範囲に収まるように希釈操作などを行います。
このような場合，SIL-30AC オートサンプラの前処理機能を用いることにより，分析種標準原液のみをSIL-30AC にセットするだけで，任意倍率の希釈標準液を自動調製して，そのままカラムへ注入することが可能となります。また，同様に試料溶液についても，試料原液を任意の倍率に自動希釈して注入することができます。
以下に，絶対検量線法によるコーヒーおよび紅茶中のカフェイン分析に応用した事例を示します。
希釈標準液の自動調製とカラムへの導入
以下の手順で，標準液を自動希釈し，カラムへ導入しました。(図1)
| 1) | カフェイン標準原液(500 mg/L，水溶液)を調製し，SIL-30AC にセットする。 |
| 2) | このカフェイン標準原液バイアルから希釈率に応じた量を吸引し，混合用バイアル(空バイアル)に希釈液(精製水)と共に吐出する。 |
| 3) | 混合用バイアルの中で，吸引吐出によるミキシングを行う。 |
| 4) | 自動調製された希釈標準液を指定した注入量分だけ吸引し，カラムへ導入する。 |
標準液の分析結果
カフェイン標準原液をSIL-30AC を用いて，1/100，1/50，1/20，1/10，1/5 および1/2(各標準液の最終濃度5 mg/L，10 mg/L，25 mg/L，50 mg/L，100 mg/L および250 mg/L)となるように自動調製した※ 1希釈標準液を分析しました。
分析条件を表1 に，各標準液のクロマトグラムを図2 に，またこれら標準液の分析結果より得られた検量線を図3 に示します。
自動希釈操作の再現性を確認するため，自動希釈された各標準液を6 回繰り返し分析し，ピーク面積の再現性(%RSD)を算出しました。それらの結果を表2(左)に示します。
また，SIL-30AC による希釈正確さ※2を確認するため，熟練技術者が手作業により調製した希釈標準液を対照とし，SIL-30AC で自動調製した希釈標準液のピーク面積を比較しました。それらの結果 を表2(右)に示します。
| ※1 | 希釈倍率と最終容量を設定すれば，吸引量と吐出量は自動計算されます。 |
| ※2 | 希釈正確さ(%) = SIL-30AC による希釈標準液中カフェインのピーク面積÷手作業による希釈標準液中カフェインのピーク面積× 100 |
試料溶液の分析結果
標準液と同様に，SIL-30AC の自動前処理機能を用いて，試料原液(コーヒーおよび紅茶を0.2 μmメンブランフィルターでろ過)を1/10 に自動希釈して分析を行いました。
コーヒーのクロマトグラムを図4 に，紅茶のクロマトグラムを図5 に示します。
