標準液・試料溶液の自動希釈調製分析法

UHPLC Technical

LCtalk79号 TEC
HPLC 分析において,標準液や試料溶液の希釈調製は通常手作業で行われますが,このような作業には経験や知識が必要な上,手間と時間がかかることも少なくありません。このプロセスを自動化できれば,分析のスループットを大きく向上させることが期待できます。
ここでは,超高速LC“Nexera X2”シリーズ SIL-30AC オートサンプラの前処理機能を活用して,標準液や試料溶液を自動希釈調製することにより,絶対検量線法による定量分析を省力化した例をご紹介します。

絶対検量線法における標準液・試料溶液の調製

HPLC による定量分析で広く用いられる絶対検量線法では,既知濃度の分析種標準液を数点調製し,これらを分析することにより,濃度とピーク面積あるいはピーク高さとの関係式,つまり検量線を得ます。そして,この検量線を用いて試料溶液を分析して得られたピーク面積あるいはピーク高さから分析種の濃度を算出します。この時,基本的に検量線は直線となる濃度範囲で設定し,試料溶液もその範囲に収まるように希釈操作などを行います。

このような場合,SIL-30AC オートサンプラの前処理機能を用いることにより,分析種標準原液のみをSIL-30AC にセットするだけで,任意倍率の希釈標準液を自動調製して,そのままカラムへ注入することが可能となります。また,同様に試料溶液についても,試料原液を任意の倍率に自動希釈して注入することができます。

以下に,絶対検量線法によるコーヒーおよび紅茶中のカフェイン分析に応用した事例を示します。

希釈標準液の自動調製とカラムへの導入

以下の手順で,標準液を自動希釈し,カラムへ導入しました。(図1)
       

1)  カフェイン標準原液(500 mg/L,水溶液)を調製し,SIL-30AC にセットする。
2)  このカフェイン標準原液バイアルから希釈率に応じた量を吸引し,混合用バイアル(空バイアル)に希釈液(精製水)と共に吐出する。
3)  混合用バイアルの中で,吸引吐出によるミキシングを行う。
4)  自動調製された希釈標準液を指定した注入量分だけ吸引し,カラムへ導入する。
希釈標準液の自動調製手順
図1 希釈標準液の自動調製手順

標準液の分析結果

表1. 分析条件
表1 分析条件

カフェイン標準原液をSIL-30AC を用いて,1/100,1/50,1/20,1/10,1/5 および1/2(各標準液の最終濃度5 mg/L,10 mg/L,25 mg/L,50 mg/L,100 mg/L および250 mg/L)となるように自動調製した※ 1希釈標準液を分析しました。

分析条件を表1 に,各標準液のクロマトグラムを図2 に,またこれら標準液の分析結果より得られた検量線を図3 に示します。

図2 カフェイン標準液のクロマトグラム
図2. カフェイン標準液のクロマトグラム
図3 カフェインの検量線
図3. カフェインの検量線

自動希釈操作の再現性を確認するため,自動希釈された各標準液を6 回繰り返し分析し,ピーク面積の再現性(%RSD)を算出しました。それらの結果を表2(左)に示します。

また,SIL-30AC による希釈正確さ※2を確認するため,熟練技術者が手作業により調製した希釈標準液を対照とし,SIL-30AC で自動調製した希釈標準液のピーク面積を比較しました。それらの結果 を表2(右)に示します。
   

※1 希釈倍率と最終容量を設定すれば,吸引量と吐出量は自動計算されます。
※2 希釈正確さ(%)
= SIL-30AC による希釈標準液中カフェインのピーク面積÷手作業による希釈標準液中カフェインのピーク面積× 100
表2  標準液繰り返し再現性結果(左)と 各希釈倍率における希釈正確さ(右)
表2. 標準液繰り返し再現性結果(左)と各希釈倍率における希釈正確さ(右)

試料溶液の分析結果

標準液と同様に,SIL-30AC の自動前処理機能を用いて,試料原液(コーヒーおよび紅茶を0.2 μmメンブランフィルターでろ過)を1/10 に自動希釈して分析を行いました。

コーヒーのクロマトグラムを図4 に,紅茶のクロマトグラムを図5 に示します。

図4 コーヒー(1/10 希釈)のクロマトグラム
図4 コーヒー(1/10 希釈)のクロマトグラム
図5 紅茶(1/10 希釈)のクロマトグラム
図5 紅茶(1/10 希釈)のクロマトグラム

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