vol.8 赤外分光法によるタンパク質の構造機能解析

■タンパク質のFTIRスペクトルを得るための水蒸気除去、水の引き方
　低分子化合物の固体サンプル、有機溶媒などの測定では、分光器のパージなどをそれほど気にしなくても満足できるスペクトルが得られる。しかし、タンパク質水溶液のスペクトルでの基本的な注意点は、光路上の水蒸気の除去と溶媒を差し引く演算処理である。これらの操作をいい加減に行うと、データの解析、特に二次微分演算処理でスペクトルの質を落としてしまう。
＜水蒸気除去＞
　乾燥空気供給装置が備わっている分光器であれば、実験前日からパージを始めれば、分光器内の水蒸気はかなり除去できる。サンプル部とリファレンス部を備えたデュアルビームの装置であれば、水蒸気のことをそれほど気にしなくても水蒸気の影響の少ないスペクトルが得られる。しかし、乾燥空気供給装置がない場合、たいていは窒素ガスでパージすることになり、窒素ボンベを消耗品として使うので、測定の度に前日からパージするわけにはいかない。さらに分光器がシングルビームタイプであれば測定時間がずれることから水蒸気は後から差し引くことになる。分光器メーカーによってはデフォルトとして水蒸気除去プログラムが入っているところもある。実際にこの除去プログラムを使うと、一見スペクトルから水蒸気が消えているように見える。赤外スペクトルに特に演算処理を施さないのであれば、このプログラムを活用したほうが見映えみは良くなる。しかし、タンパク質の主鎖ならび側鎖の構造解析においては、このようなプログラムはあまり役に立たないどころか、かえってアーティファクトを生んでしまう原因になる。水蒸気はそのときの温度、湿度などの環境で変化するので、水蒸気のバンドを消すためには、その日に測定した水蒸気のスペクトルを用いることが望ましい。実際に、数時間以内で測定した水蒸気であれば、かなり水蒸気を除去することができる。最終的には、サンプルによるバンドがない2000～1700 cm^-1の領域で水蒸気のシャープなバンドが出ていないことで確認できる。最近は、マクロの透過型測定よりもATR測定や顕微赤外測定の方がかえって簡便になってきたが、分光器にATRユニットや顕微赤外ユニットを外づけのアクセサリーとして用いると、測定はシングルビームになる。しかもアクセサリーは意外にパージに関する配慮が十分になされていないことが多いので、水蒸気に関しては注意が必要である。
＜水の差し引き＞
　重水の場合はDOD変角振動が1200 cm^-1付近に現れるので、アミドＩ領域（1700-1600 cm^-1）を解析するのにバンドのオーバーラップを気にする必要はない。しかし、軽水の場合は、水のHOH変角振動とタンパク質のアミドＩバンドが重なるので、水を引くときは2300～2000 cm^-1の水の結合音と考えられるブロードなバンドが平らになるように差をとるのが一般的である。水の差し引きを円滑に行うためには、試料のサンプルの厚みをスペーサーで15 μm以下にすることである。20 μmの厚さで水の吸光度は２近くになるので1650 cm^-1付近のバンドが飽和してしまう。透過法を用いずにATR法を用いると、水の吸収を低く抑えることができるので、タンパク質水溶液の測定には有効である。
　今回紹介するカルシウム結合タンパク質の側鎖COO^-基の研究では、COO^-逆対称伸縮振動バンドを解析するために、アミドⅡバンドとの重なり避けることが必要となり、重水溶液での測定が必要になる。タンパク質主鎖のNHはすべてD化し、重水溶液試料を準備した。タンパク質濃度は1～2 mMに調製した。測定はすべて透過型（マクロ）で行った。

 

Figure 1
Coordinating structures of the side-chain

COO^-groups to M²⁺in (A) unidentate,

(B) bidentate, and (C) bridging modes.

 

 

Figure 2
Infrared absorption spectra of (a) apo,

(b) Mg²⁺-bound, and (c) Ca²⁺-bound

Akazara scallop troponin C in solutions

containing 40 mM Hepes-NaOD (pD 7.4)

and 100 mM KCl.

 

 

Figure 3
FTIR second-derivative spectra of (a)

apo, (b) Mg²⁺-bound, and (c) Ca²⁺-

bound Akazara scallop troponin C in

solutions. Second-derivatives are

multiplied by -1.

 

■アカザラガイトロポニンC(天然型)の金属イオンとの特異的相互作用⁵⁾
　トロポニンC(TnC)は筋収縮を制御するCa²⁺結合タンパク質である⁶⁾。脊椎動物の骨格筋や心筋では、細胞内のCa²⁺濃度に応じて、TnCは最大４つのCa²⁺を結合し、立体構造を変化させることにより、筋収縮のonとoffを制御している。一方，無脊椎動物のアカザラガイ閉殻筋TnCは、脊椎動物のTnC同様、４つのEFハンドモチーフ（helix-loop-helix）⁷⁾をもつにもかかわらず、１つしかCa²⁺を結合しない⁸⁾。このカルシウム結合部位は最もＣ端側のEFハンドモチーフ（サイトⅣ）に位置する。そこで、アカザラガイトロポニンC並びにその変異体のCa²⁺，Mg²⁺配位構造についてFTIRを用いて解析した。赤外COO^-逆対称伸縮振動バンドは金属イオンに結合するグルタミン酸（Glu, E）もしくはアスパラギン酸（Asp, D）側鎖COO^-基の配位様式についての情報を与え、その波数に基づいて，unidentate型，bidentate 型，birdging 型などの配位様式（図１）を識別することができる^{9), 10)}。bridging型の２つの金属イオンのうち一つが水分子などに置き換わる場合をpseudo-bridging型といい、タンパク質水溶液中ではunidentate型は実際にはpseudo-bridging型になっていると考えられる¹¹⁾。
　通常の赤外吸収スペクトルだけでは金属イオンの結合による構造変化を比較することは難しいので、二次微分演算あるいはフーリエセルフデコンボルーションなどの演算処理を施す必要がある。図2にapo型（二価金属イオンフリー型），Mg²⁺結合型，Ca²⁺結合型の赤外吸収スペクトル、図3に二次微分スペクトルを示す。赤外吸収スペクトルだけを眺めてもよく似ているということぐらいしか議論できない。しかし、二次微分演算を施すと、側鎖に関する詳しい議論ができるようになる。図３においてCa²⁺結合型のみで1543 cm^-1にバンドが現れたが，これはGlu142の側鎖COO^-基がCa²⁺と二座配位型で結合したものと解釈した。一方，Mg²⁺結合型の1600 cm^-1及びCa²⁺結合型の1586 cm^-1のバンド強度の増大は，Asp131とAsp133の側鎖COO^-基がMg²⁺およびCa²⁺とpseudo-bridging型で結合したことを示唆した。生理的条件下では、offではMg²⁺がonではCa²⁺がトロポニンＣと結合する可能性が考えられるので、on/offの機構として図４に示す配位構造のモデルが考えられる。蛇足ではあるが、もしも水蒸気の引き残りがあると、二次微分演算で水蒸気のピークがエンハンスされて、タンパク質の情報がかき消されることになったであろう。

Figure 4
A schematic model of changes in coordination structure of the
Ca²⁺binding site of Akazara scallop troponin C accompanying the
exchange of Mg²⁺with Ca²⁺.

 

Figure 5
Infrared second-derivative spectra of apo, Mg²⁺-loaded

and Mg²⁺/Ca²⁺loaded E142D and E142Q mutants.

Sample solutions were [TnC] = 2 mM, [KCl] =100 mM

for the apo state, [TnC] = 2 mM, [Mg2+] = 20 mM, [KCl]

=100 mM for the Mg²⁺-loaded state and [TnC] = 2 mM,

[Mg²⁺] = 20 mM, [Ca²⁺] = 20 mM, [KCl] =100 mM for the

Mg²⁺-loaded state.

 

■ E142Q変異体のMg²⁺，Ca²⁺配位構造^{12), 13)}
　結合サイトIVの12番目のグルタミン酸をグルタミン(Gln, Q)で置き換えた変異体をE142Qと呼ぶことにする。E142Qの赤外二次微分スペクトルを調べると、Mg²⁺負荷状態で1600 cm^-1のバンド強度が増加したことにより、Asp131, Asp133の側鎖COO^-基はpseudo-bridging型でMg²⁺と結合したものと考えられる。この結果は、これまで天然型のMg²⁺結合に伴うスペクトル変化の結果とほぼ一致した。そこで、Mg²⁺滴定を行って1600 cm^-1のバンドの強度変化を調べたところ、Mg²⁺の親和性は天然型とE142Qでほぼ同じであることがわかった。したがって，天然型のGlu142側鎖COO^-基はMg²⁺配位に関与していないことが結論づけられた。また、E142QのMg²⁺結合の影響についてCDや蛍光スペクトルでも調べたところ、天然型と同じ挙動を示した。一方、Ca²⁺負荷による影響は、12位の側鎖COO^-基がなくてもAsp131とAsp133の側鎖COO^-はCa²⁺と結合することがわかった(図５d-f)。しかし、CDや蛍光スペクトルを測定するとCa²⁺結合の効果は天然型のものとは異なり、Glu142側鎖COO^-基がアカザラガイトロポニンＣの活性化のon/off機構に直接関わっていることが示唆された。E142D変異体に関しても同様にCa²⁺と結合としても1543 cm^-1にはバンドが現れなかったが、Mg²⁺結合状態で観測される1600 cm^-1のバンドがCa^2＋負荷により消えたことにより、結合サイトIVにCa²⁺が入ったことが示された(図5 a-c)。

 

Figure 6　
Infrared second-derivative spectra for synthetic 17-

residue peptide analogues for the calcium binding Site

IV of Akazara scallop TnC (wild type) (a, b) and site

directed mutated ones (E142D (c, d), E142Q (e, f) and

E142A (g, h)) in the apo and Ca²⁺-loaded states.

 

■ 合成ペプチドアナログによるアプローチ^{13) ,14)}
　タンパク質の側鎖の帰属には、アミノ酸やペプチドなどのモデル化合物のスペクトルと比較するのが常套手段である。ウサギ骨格筋トロポニンCのサイトⅢに関してNMRによる報告¹⁵⁾が1980年代にされていたので、まずこのペプチドに焦点を当てて解析を行った。その結果、カルシウム結合部位に相当するペプチドはCa²⁺と結合せず、COO^-基の二座配位のバンドが観測されるためにはカルシウム結合サイト12残基の他に少なくともC端側に５残基のばしたもの、すなわち17残基の鎖長が必要であることがわかった¹⁴⁾。そこで、アカザラガイトロポニンCのサイトIVについても17残基の合成ペプチドアナログを用いて赤外測定を行った。結合部位の12位のグルタミン酸を他のアミノ酸で置き換えたペプチドを用いて、COO^-逆対称伸縮振動領域を調べたところ、天然型のモデルペプチドでは1545 cm^-1付近にバンドが観測されたが、置換型のモデルペプチドでは観測されなかった(図６)。この結果、これまでにアカザラガイトロポニンCで帰属した1543 cm^-1のバンドは142位のグルタミン酸がCa²⁺と二座配位型で結合したことに由来することを裏付けることができた。また、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換したE142DペプチドでもCOO^-逆対称伸縮振動バンドの低波数シフトが観測されなかったということは、側鎖のメチレン基が１つ欠けただけでも配位構造に重大な影響を与えることを示唆するものであり、タンパク質の構造機能相関を理解するために興味深いデータと考えられる。

■結語
　カルシウム結合タンパク質と金属イオンとの特異的相互作用を調べる方法として、FTIRが有用なアプローチであることを紹介した。特に変異体やモデルペプチドを利用することにより，カルシウム結合タンパク質の活性化のon/off機構を直接的に解明できることが期待される。
　タンパク質構造に関してX線結晶構造解析や多次元NMRで得られる情報量に比べればFTIRで得られる情報量ははるかに少ない。しかし、構造と機能との相関に関わる情報がピンポイントで得られるという点がFTIRの特徴と考えられる。今後FTIRが活躍しそうな研究テーマとしてintactな状態でのタンパク質構造解析が挙げられる。不溶性タンパク質や不均一な生体システムはX線結晶構造解析やNMRといった構造生物学の常套手段が苦手とする研究対象である。それに対してFTIRは基本的にサンプルの状態によらず測定可能である。例えば、ウシ卵子の表層部に存在する透明帯タンパク質を非破壊的に測定できる手段としてATR/FTIRが有用であることを明らかにした¹⁶⁾。このように生物システムのintactなタンパク質に焦点を当てていくと、FTIRの有用性はさらに高まるものと期待できる。

■謝辞
　アカザラガイトロポニンCのFTIRに関する研究は、東京大学大学院農学系研究科の田之倉優教授の協力でここまで発展してきた。タンパク質の精製、調製では湯本史明博士の協力を得た。また、カルシウム結合部位の合成ペプチドアナログは産業技術総合研究所の森井尚之博士に提供していただいた。

文献

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