カラムを用いて分離する 〜カラムを用いて適切なピークが得られることを確認する〜

この検討過程も，ほとんどの化合物では問題なくクリアできるはずですが，極まれにこの過程で問題が起こることがあります．その対策について少しふれます。

(1)カラムから溶出しない
　強い疎水相互作用を示す化合物はアセトニトリル/水(=9/1)で溶出できない化合物も出てきます。 トリグリセライドやクロロフィルなどは，この条件で速やかにカラムを通過させることはできません。 この場合には大幅な条件検討が必要になります。
　つまり，1) より溶出力の高い移動相であるアセトンやメタノール・イソプロパノール混液に移動相を変更する（逆相系分離を前提とした対策）。　別の方法として，2) 異なる分離モード（順相系など）を検討することがあります。　しかし，順相系でよく用いられる移動相はヘキサン，ベンゼン，クロロホルム，酢酸エチルなど大気圧イオン化に適さない溶媒であるため，単純に順相系のカラムや移動相への交換だけではLC-MSには適用できません。　イオン化に都合の良いメタノール，アセトンなど（基本移動相）が移動相として加えることができるかどうか？がLC-MS分析に適用できるかの鍵となります。

(2)ピーク形状が悪い
　カラムを用いたFI様分析で，たまにピークテーリングが観察されることがあります。　この場合，移動相pHを少しふってみます。　この分析条件では，ぎ酸を加えた水を用いていますが，移動相BにはLC-MSの分析条件について（その1）でお話したように酸を加えていません。
　そこで，有機溶媒比率を少し下げて同様の分析を行った場合に，ピーク形状の改善が見られるかどうかを確認するわけです。　逆相条件なので，有機溶媒比率を減らせば，保持時間は長くなりますが酸の影響で，ピーク形状が改善する化合物があります。　改善が見られる場合には，有機溶媒にも酸を添加した移動相に変更することで良好な結果が得られます。　オキソリン酸やニューキノロン系抗菌剤（サラフロキサシンのなど）がこれに相当します。

(3)マススペクトルのパターンを確認
　先に示した理由によりFIAとは観察される分子イオン種が変わります。　未知化合物の同定では，様々なイオン種の出現が分子量決定に役立ちます（その2参照）が，定量分析を目的とする場合，イオン種をそろえる方が感度や安定性を高めます。

アセトニトリル-ぎ酸水系を用いた分析ですが，

A) アンモニウムイオン付加型分子（正イオン）が観察される場合*
　ぎ酸をぎ酸アンモニウムに変更し，アンモニウムイオン付加型分子の強度を高めます。

B) 塩素イオン付加型分子（負イオン）が観察される場合*
　塩素イオンの供給源として，移動相にまたはポストカラムで塩素系溶媒を添加します。

C) 負イオン分析で脱プロトン分子が観察される場合
　ぎ酸を除く，ぎ酸アンモニウムを添加することで，移動相のpHを上げ，目的化合物の感度を向上させます。

D) ぎ酸イオン付加型分子が確認される場合
　基本移動相条件でのぎ酸付加型分子の強度とぎ酸を含まない系での脱プロトン分子の強度比較をおこない良好な条件を選択します（単純なイオン強度ではなく，S/Nで判断することをお薦めします）。

*アンモニウムイオン付加型分子や塩素イオン付加型分子のアンモニウムイオンや塩素イオンの由来は，カラムや流路に残存していたものと考えられます。

第一選択移動相として用いた基本移動相は，塩基性化合物（正イオン分析）に適した条件であるため，酸性化合物が対象となる場合，いろいろと検討が増える傾向があります。　(Mu)