東京大学大学院理学系研究科

最近，生命の設計図であるゲノム情報を書き換える「ゲノム編集」技術が注目されています。ゲノム編集には細菌に由来するRNA依存性DNA切断酵素Cas9が利用されています。わたしたちは立体構造解析や生化学的解析により，Cas9がガイドRNAと協働して標的DNAを切断する分子機構の解明を目指して研究しています。さらに，分子構造をもとにCas9タンパク質を改変することにより，新たなゲノム編集ツールの開発にも挑戦しています。

参考URL：https://www.s.u-tokyo.ac.jp/ja/press/2018/6021/

参考URL：https://first.lifesciencedb.jp/archives/18665

Cas9の機能解析や機能改変には，Cas9のDNA切断活性を正確に測定することが重要です。培養細胞におけるCas9のゲノム編集効率は，DNA切断効率に加えて，Cas9の導入効率や標的サイト周辺のクロマチン状態，DNA二本鎖切断の修復効率など様々な影響を受けます。したがって，Cas9のDNA切断活性を正確に評価するためには，高純度に精製したCas9タンパク質，ガイドRNA，標的DNAを試験管内で混合し，標的DNAの切断反応のタイムコースを測定する必要があります。わたしたちは，DNA切断実験におけるDNA（基質と切断産物）の定量にMultiNAを利用しています。ヘテロ二本鎖移動度分析によるゲノム編集効率の評価にMultiNAを利用されているユーザーの方が多いと思いますので，通常とは異なる使い方だと思います。

関連手順：https://science.sciencemag.org/content/361/6408/1259.long

MultiNAを導入する前は，切断反応後のDNAをアガロースゲル電気泳動を用いて解析していました。具体的には，Cas9タンパク質，ガイドRNA，標的DNAを0.5，1，2，5分間反応させた後，1サンプル（10 µL）ずつウェルにロードし，電気泳動，ゲルを染色・撮影し，基質DNA（3 kb）と切断産物（2 kbと1 kb）に対応するバンドを定量することにより，DNA切断活性を算出します。この方法ですと，DNA切断反応を正確に行ったとしても，それ以降の複数のステップにおいて誤差が生じてしまうため，DNA切断活性を正確に決定するのは困難でした。また，一度に電気泳動できるサンプル数は限られているため，迅速な解析は不可能でした。
さらに，ウェルに穴が空いていた，ゲルの染色がよくない，ゲルを落として破損した，などの予期せぬアクシデントがあると，切断実験からやり直さなければなりません。サンプルが多くなると，バンドの定量やデータの管理も容易ではありませんでした。一方，MultiNAは一度に96サンプルに関して，電気泳動から切断産物の定量まで自動で行ってくれるため，DNA切断反応後の解析効率が劇的に向上しました。必要なサンプル量も1/5になりました。SpCas9-NG改変体の論文（Nishimasu et al. Science 2018）には，約450ポイント（n = 3）の切断実験データが掲載されていますが，アガロースゲル電気泳動を用いて同様の精度のデータを得るのは，現実的に不可能でした。「MultiNAがなければ，SpCas9-NG改変体の開発は不可能だった」と感じています。