Transdirect insect cell

無細胞タンパク質合成試薬キット

よくあるご質問 - FAQ -

ここでは、お客様からよくある質問について記載します。
これ以外の質問については、お問い合わせフォームで入力送信してください。あるいは弊社営業窓口まで直接お問い合わせいただいても結構です。弊社担当者よりご連絡差し上げます。

Q mRNA精製を簡略化できませんか?
A 最大のタンパク質合成量を得るためには精製することをお奨めします。しかし、多少合成量が落ちても良い場合は、mRNA合成液にEDTAを加えることでも合成反応を行って頂けます。詳細は、アプリケーションデータ(4)プロトコルをご参照下さい。
Q 膜タンパク質は合成できますか?New!(2012.10.17情報更新)
A 一般的には難しいですが、現在、東北大学との共同研究にて膜タンパク質発現系構築に取り組んでいます。これまでに反応系にミクロソーム膜を添加することで幾つかの膜蛋白質について発現に成功しています。 共同研究内容はこちらをご覧ください。
Q ジスルフィド結合を含有するタンパク質は合成できますか?
A 合成反応液に還元剤のDTTが含まれるため、そのままの反応ではジスルフィド結合が生じません。特注品でDTTを含まない試薬キットもご用意しております(詳細はお問合せ下さい)。ジスルフィド結合含有タンパク質の合成例はアプリケーションデータ(5)参考文献をご参照下さい。
Q 合成タンパク質可溶性はどの程度でしょうか?
A ほとんどのタンパク質は可溶性として得られますが、不溶化が顕著なときは界面活性剤の添加をご検討下さい。界面活性剤についてはプロトコルをご参照下さい。
Q どのメーカーのmRNA合成キットを使えば良いでしょうか?
A 各社から市販されております大量合成キットをお奨めします。推奨キットは取扱説明書をご参照下さい。
Q アフィニティ精製用のタグ配列が挿入されたpTD1ベクターはありますか?
A ご不便をおかけしますが、タグ配列を挿入したpTD1は扱っておりません。ユーザー様での挿入をお願いします。
Q タンパク質が合成できない。合成タンパク質のサイズが非常に小さい。
A 念のために挿入領域の配列をご確認下さい。稀にクローニング中に変異が導入されることがあり、ストップコドンが生じたりすることがあります。

プロトコル - Protocol -

Transdirect insect cell 開発担当者が日々の開発で使用している実験プロトコルです。
注意点も合わせて記述していますので、お困りの際には是非ご活用下さい。

■ 発現ベクターの構築

Transdirectinsect cellの能力を最大限に引き出すため、目的遺伝子を添付の発現ベクター(pTD1)にクローニングすることをお勧めします。ここでは、インサートDNAの調製をPCR法で行いpTD1にクローニングする方法を説明します。

プロトコルPDF プロトコル(PDFファイル)

目的遺伝子をクローニング後は、必ずシーケンスにより確認するようにして下さい。合成できないトラブルの中で、インサートが入っていないという事例が多くあります。また、クローニング中に開始コドンなどに変異が入る場合もありますので、全長のシーケンス確認を推奨します

■ mRNA合成&精製

RNA合成はナーバスになりがちな作業であるかと思いますが(実際にユーザー様からの問い合わせも多い)、ラテックス手袋を着用し、喋らずに黙って作業すれば通常の実験室で行ってもまず失敗することはありません。チップやチューブも無菌操作で使用する程度のオートクレーブ処理で十分ですし、使用する水も滅菌蒸留水で問題ありません。推奨プロトコルで合成・精製して頂ければ、うっかり室温で一晩放置、という場合でも全く問題なくタンパク質合成を行えます。

mRNAの合成には市販のRNA大量合成キットをご使用下さい(詳細は取扱説明書8ページをご参照下さい)。いずれのキットを用いる場合でも、各キットの取扱説明書に従って行って頂ければ特に問題になることはありません。また、mRNA精製の目的は、未反応NTPと塩の除去です。未反応のNTPは、分光光度計を用いたmRNA濃度定量時に検出されてしまうため正確な定量を妨げます(見かけ上、mRNA量が増加します)。タンパク質合成時のmRNA濃度は非常に重要ですので、mRNAの正しい定量が必要です。そのため、ゲル濾過カラムによる未反応NTPの除去を推奨しております。これらの詳細についてはプロトコルを参照ください。

タンパク質合成量が15%程度減少しますが、mRNAの精製工程を省略したタンパク質合成方法(Link法)のプロトコルも示します。Link法の詳細については、アプリケーションデータ(4)をご参照下さい。

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■ タンパク質合成

通常のタンパク質合成は、取扱説明書に従って行って頂ければ特に問題になることはありません(混ぜるだけ)。標準スケールでの合成は取扱説明書(p.11)をご覧下さい。必要に応じてスケールアップ・ダウンして合成を行って頂けます。また大容量(例えば10mL)にて合成を行っていただく場合に、お得なバルクキットもございますので、是非御活用ください。

ここでは、疎水性の高いタンパク質や合成量の低いタンパク質など、難易度の高いタンパク質を合成する場合に有効なプロトコルを示します。但し、全てのタンパク質に有効ではないことは予めご了承下さい。

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■ 合成タンパク質のアフィニティ精製

Transdirectを用いて合成したタンパク質を簡便に精製するために、FLAG®-tag(Sigma-Aldrich社)またはstrep-tag®(IBA社)を推奨します(His-tagも使用可能ですが、種々の抽出液由来のタンパク質がコンタミします。尚その他のアフィニティタグに関しては検討しておりません。)。用いるタグとその導入位置に大きく依存しますが、典型的な例として、1mLの反応液あたり10-20µgのタンパク質が取得できます。

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