Transdirect insect cell

無細胞タンパク質合成試薬キット

プロトコル - Protocol -

Transdirect insect cell 開発担当者が日々の開発で使用している実験プロトコルです。
注意点も合わせて記述していますので、お困りの際には是非ご活用下さい。

■ 発現ベクターの構築

Transdirectinsect cellの能力を最大限に引き出すため、目的遺伝子を添付の発現ベクター(pTD1)にクローニングすることをお勧めします。ここでは、インサートDNAの調製をPCR法で行いpTD1にクローニングする方法を説明します。

プロトコルPDF プロトコル(PDFファイル)

目的遺伝子をクローニング後は、必ずシーケンスにより確認するようにして下さい。合成できないトラブルの中で、インサートが入っていないという事例が多くあります。また、クローニング中に開始コドンなどに変異が入る場合もありますので、全長のシーケンス確認を推奨します

■ mRNA合成&精製

RNA合成はナーバスになりがちな作業であるかと思いますが(実際にユーザー様からの問い合わせも多い)、ラテックス手袋を着用し、喋らずに黙って作業すれば通常の実験室で行ってもまず失敗することはありません。チップやチューブも無菌操作で使用する程度のオートクレーブ処理で十分ですし、使用する水も滅菌蒸留水で問題ありません。推奨プロトコルで合成・精製して頂ければ、うっかり室温で一晩放置、という場合でも全く問題なくタンパク質合成を行えます。

mRNAの合成には市販のRNA大量合成キットをご使用下さい(詳細は取扱説明書8ページをご参照下さい)。いずれのキットを用いる場合でも、各キットの取扱説明書に従って行って頂ければ特に問題になることはありません。また、mRNA精製の目的は、未反応NTPと塩の除去です。未反応のNTPは、分光光度計を用いたmRNA濃度定量時に検出されてしまうため正確な定量を妨げます(見かけ上、mRNA量が増加します)。タンパク質合成時のmRNA濃度は非常に重要ですので、mRNAの正しい定量が必要です。そのため、ゲル濾過カラムによる未反応NTPの除去を推奨しております。これらの詳細についてはプロトコルを参照ください。

タンパク質合成量が15%程度減少しますが、mRNAの精製工程を省略したタンパク質合成方法(Link法)のプロトコルも示します。Link法の詳細については、アプリケーションデータ(4)をご参照下さい。

プロトコルPDF プロトコル(PDFファイル)

■ タンパク質合成

通常のタンパク質合成は、取扱説明書に従って行って頂ければ特に問題になることはありません(混ぜるだけ)。標準スケールでの合成は取扱説明書(p.11)をご覧下さい。必要に応じてスケールアップ・ダウンして合成を行って頂けます。また大容量(例えば10mL)にて合成を行っていただく場合に、お得なバルクキットもございますので、是非御活用ください。

ここでは、疎水性の高いタンパク質や合成量の低いタンパク質など、難易度の高いタンパク質を合成する場合に有効なプロトコルを示します。但し、全てのタンパク質に有効ではないことは予めご了承下さい。

プロトコルPDF プロトコル(PDFファイル)

■ 合成タンパク質のアフィニティ精製

Transdirectを用いて合成したタンパク質を簡便に精製するために、FLAG®-tag(Sigma-Aldrich社)またはstrep-tag®(IBA社)を推奨します(His-tagも使用可能ですが、種々の抽出液由来のタンパク質がコンタミします。尚その他のアフィニティタグに関しては検討しておりません。)。用いるタグとその導入位置に大きく依存しますが、典型的な例として、1mLの反応液あたり10-20µgのタンパク質が取得できます。

プロトコルPDF プロトコル(PDFファイル)

Top of This Page